Иммуноферментный анализ

Чем определяет специфичность и чувствительность ИФА-реакции

Для создания чувствительной и надёжной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего антигенного многообразия возбудителя выбрать антигены, отвечающие определённым критериям. Во-первых, они должны быть иммуногенными, то есть в инфицированном организме должны вырабатываться антитела именно к этим антигенам в ответ на введение возбудителя. Во-вторых, антигены должны быть специфичными, то есть характерными для конкретного возбудителя и не дающих перекрёстных реакций с антителами к возбудителям других заболеваний. Кроме того, помимо рационального выбора антигенов большое влияние на конечный результат диагностики имеет качество очистки антигенов, особенно если они были получены с помощью рекомбинантных технологий.

Наша технология получения рекомбинантных белков позволяет получить и очистить практически любой вирусный и бактериальный антиген. Выполнение этой задачи состоит из 3 этапов:

Выбор иммуногенов

На этом этапе мы отбираем потенциальные наиболее иммуногенные белки-кандидаты. Мы проводим таксономический анализ возбудителя, собираем данные о структуре поверхностных белков возбудителя и их гомологов

В случае вирусного возбудителя особое внимание уделяется белкам капсида, в случае бактериального — поверхностным мембранным белкам. На основании анализа полученных данных мы выбираем наиболее экспонированные в окружающую среду эпитопы возбудителя, против которых у хозяина могут вырабатываться антитела

Наработка антигенов в бакуловирусных векторах

Основная проблема возникает при получении рекомбинантных белков в бактериальных системах E.coli. Как правило, именно эти системы и используются при наработке нужных белковых соединений. Бактерии размножаются очень быстро, что позволяет быстро и много получить необходимого белка. Как показывали наши предварительные исследования, здоровые животные в хозяйствах демонстрируют высокий титр антител против белков E.сoli. Поэтому, при использовании антигенов полученных в E.сoli мы часто получали при постановке ИФА-реакции ложноположительные результаты. В итоге, была использована система на основе бакуловирусных векторов, которые нарабатывались в коммерческих линиях клеток насекомых. Это позволило избавиться от перекрестных реакций.

Получение антител для положительного стандарта.

Для подтверждения надежности реакции и исключения ложноотрицательных реакций необходимо использовать положительный стандарт. Технология получения сыворотки антител к выделенному вирусному фрагменту для дальнейшего использования этих антител в качестве положительного стандарта, уникальна и впервые применена для такого рода диагностических тестов. Структура и стабильность полученных антител позволяет массово продуцировать их в клеточных культурах, что полностью избавляет от необходимости иметь собственный дорогостоящий виварий для их получения. Таким образом, антитела к положительному и отрицательному стандарту представлены в виде водного раствора, а не кровяной сыворотки, что повышает их стабильность и время хранения.

Как делают анализ

После подготовки исследуемого материала врач-лаборант приступает к необходимым манипуляциям. Для этого используются ряд специальных наборов антигенов, обдающих свойством спровоцировать ответные реакции организма на раздражитель, это разнообразные инфекции, гормоны, аллергены.

Схема ожидаемой реакции «антиген-антитело» выглядит приблизительно так:

Первичная реакция — определяемый Ig (Ab) и очищенный антиген возбудителя (Ag).
Для обнаружения получившихся иммунных комплексов далее следует новая иммунологическая реакция, где антигеном выступает связанный специфический Ig, а антителом для него выступает коньюгат- Ig (Ab).
Последний этап — ферментативная реакция, вместе с катализатором молекулой коньюгата. Субстратом выступает хромоген (не окрашенный), который в процессе протекания реакции окрашивается, и интенсивность цвета и определяется количественный показатель иммуноглобулина в пробе.

В настоящий момент разработано множество разнообразных вариантов ИФА, четкая классификация их отсутствует. Обычно, методы рассматриваются исходя из разделения её на гетеро- и гомогенные — все фазы анализа происходят с применением твердой фазы или с использованием только раствора.

Современные клинико-диагностические лаборатории обычно используют гетерогенный (твердофазный) ИФА, в нем под твердой фазой подразумевается абсорбция антигенов или антител на твердой поверхности специальных лунок, расположенных на полистироловом микропланшете, метод подразделяется на прямой и непрямой ИФА.

При прямом ИФА, вносимый антиген закрепляет в период инкубационного процесса на поверхности пустых лунок, для этого исследуемые пробы материал помещают в чистые лунки на 20-25 минут, это нужно для прикрепления антигена к их поверхности. После этого происходит добавление необходимого антитела. Далее материал остается на определенное время для образования связей.

Антитела всегда добавляют в избытке, поэтому даже при их наличии в пробе остаются не связанные антигены, а если антигенов нет совсем, то связей не будет. Чтобы удалить«лишние» антитела проводится декантация, после чего остаются только те антитела, которые создали связь с антигеном.

При непрямом методе ИФА используемые антитела, заранее соединенные с субстратом ферментативной реакции; в этом случае связь антител с антигеном происходит в период инкубационного процесса, после чего происходит мобилизация связей на поверхности лунок, а вносимый после конъюгат и субстратно-хромогенный реагент окрашивают реакцию.

Таким образом, главным отличием непрямого от прямого метода является не приклеивание материала к поверхности чистых лунок, а связывание с антигеном, иммобилизованным на планшете.

Останавливается протекание реакции с применением специализированных устройств, далее каждая лунка подвергается процессу фотометрирования, за которым следует сравнительная характеристика полученного результата с проведенными ранее контрольными пробами.

Если обнаруживается повышение оптической плотности в пробе, то завышена и концентрация специфических антител в исследуемом результате.

Основные понятия и принцип метода иммуноферментного анализа

Иммуноферментный анализ (ИФА) — это метод лабораторной диагностики, основанный на реакции «антиген-антитело», который позволяет выявить вещества белковой природы (в том числе ферменты, вирусы, фрагменты бактерий и другие компоненты биологических жидкостей).

Чтобы понять, как устроен иммуноферментный анализ, попробуем разобраться в сути реакции «антиген-антитело». Антиген — это чужеродная для организма молекула, как правило, белкового происхождения, которая может попасть в тело человека вместе с инфекционным агентом. Частицы чужой крови (если она не совпадает с нашей по группе) также являются антигенами. В организме антигены способны вызывать иммунную реакцию, направленную на защиту целостности внутренней среды от чужеродных веществ. Поэтому наше тело синтезирует особые вещества — антитела (иммуноглобулины), способные по принципу «ключ к замку» соединяться с антигенами, связывая их в иммунный комплекс (этот процесс как раз называется реакцией «антиген-антитело»). Такие иммунные комплексы легче распознаются и уничтожаются клетками иммунитета.

Существует несколько разновидностей антител, каждая из которых вступает в действие на определенном этапе иммунного ответа. Так, первыми в ответ на проникновение антигена в организм синтезируются иммуноглобулины класса М (IgM). Содержание этих антител наиболее высоко в первые дни инфекционного процесса.

Следом за ними иммунная система выбрасывает в кровь иммуноглобулины класса G (IgG), которые помогают уничтожать антигены до полной победы над инфекцией, а также продолжают циркулировать по сосудам в дальнейшем, обеспечивая иммунитет к повторному заражению. На этом явлении основана вакцинация: благодаря прививкам, содержащим ослабленные антигены микробов и вирусов, в нашей крови появляется большое количество IgG, которые при контакте с реальной угрозой быстро подавляют инфекцию — до того, как она нанесет вред здоровью.

Также существуют иммуноглобулины класса А (они в большом количестве содержатся в слизистых оболочках, защищая «подступы» к организму), Е (борются с паразитарными инфекциями) и другие. В лабораторной диагностике объектами интереса чаще всего являются IgM, IgG и IgA: по их концентрации можно оценить, на какой стадии находится инфекционный процесс, а также узнать, болел ли когда-либо человек тем или иным недугом (например, краснухой или ветряной оспой).

Анализируемый биоматериал и особенности его забора

Основной биоматериал для проведения ИФА — это сыворотка крови: в лаборатории у пациента берут образец крови из вены, из которого в дальнейшем удаляют форменные элементы, затрудняющие проведение анализа. В некоторых других случаях для анализа используется спинномозговая жидкость, околоплодные воды, мазки слизистых оболочек и т.д.

Для того чтобы избежать искажений в результатах, рекомендуется сдавать кровь натощак, а за две недели до исследования (если целью является диагностика хронических, скрыто протекающих инфекционных заболеваний) необходимо отказаться от приема антибиотиков и противовирусных препаратов.

Сроки готовности результатов ИФА

При наличии необходимых реактивов и хорошей организации работы лаборатории результат анализа вы получите в течение 1–2 суток после забора крови. В некоторых случаях, при необходимости получения экстренного ответа, этот срок может быть сокращен до 2–3 часов.

Дополнительные исследования

Помимо перечисленных методов исследования, для определения гепатита С могут проводить биохимический анализ крови. Это информативный метод диагностики, по результатам выполнения которого можно оценить степень поражения печени, а также определить общее состояние пациента.

Биохимический анализ крови дает представление о таких важных показателях, как:

• Билирубин. В норме количество этого вещества не должно превышать 19,8 мкмоль/л. Если концентрация билирубина повышается, то это свидетельствует о наличии патологий печени. Если у пациента есть гепатит С, протекающий в легкой форме, то показатели билирубина находятся в пределах 30-86 мкмоль/л. При показателях от 87 до 160 мкмоль/л подозревают среднюю степень повреждения печени. О тяжелой форме патологии свидетельствуют показатели в пределах более 160 мкмоль/л.
• Ферменты АЛТ и АСТ. При гепатите типа С уровень этих показателей резко увеличивается. В норме у мужчин АЛТ не превышает 18 Ед/л, у женщин – 15 Ед/л. Что касается показателей АСТ, то у мужчин они не должны превышать 22 Ед/л, у женщин – 17 Ед/л.
• Белок. У пациентов с подозрением на наличие гепатита С концентрация белка часто снижается. Это указывает либо на гепатит, либо на цирроз.

Дополнительно пациенту, которого обследуют на предмет наличия вируса гепатита С, могут назначить процедуру вычисления коэффициента де Ритиса. Его суть заключается в вычислении соотношения показателей АЛТ и АСТ.

Причины и способы заражения гепатитом

Болезнь Боткина передается бытовым путем через предметы обихода, грязные руки и немытые продукты, в общем, имеет фекально-оральный способ передачи. Проходит гепатит A быстро и без ощутимых последствий. Другие вариации недуга относят к парентеральной группе (C, D и так далее), они могут долгое время никак не проявляться, но впоследствии мучить человека всю жизнь, способствуя развитию цирроза или даже рака печени. Передаются в основном через кровь во время переливания.

Способы заражения гепатитом:

• Внутриутробный путь – передается от матери к плоду.
• Использование одного шприца многими лицами – основной способ заражения наркоманов.
• Половой акт – в основном так передается гепатит B.
• Если во время прокола ушей или нанесения татуировки использовались не стерильные инструменты.
• Воздействие токсических веществ на организм и т. п.

Симптоматика у каждого варианта гепатита разная практически всегда пациент ощущает быструю утомляемость, может появиться головная боль и повыситься температура. Во время прогрессирования болезни Боткина и других видов недуга возникает желтушность кожи. Выявить заболевание помогает анализ крови.

Подготовка

Биоматериал для проведения ИФА на антинуклеарный фактор – сыворотка венозной крови.

• Венепункция выполняется в утреннее время и натощак (с момента последнего приема пищи должно пройти минимум 8 часов). Пить чистую негазированную воду можно;
• Непосредственно перед забором крови (за 2-3 часа) не рекомендуется курить и пользоваться никотинозаменителями (пластырь, спрей, жевательная резинка);
• Накануне и в день процедуры нельзя употреблять алкогольные и энергетические напитки, волноваться и заниматься тяжелой физической работой;
• За 15 дней до теста по согласованию с лечащим врачом отменяется прием лекарственных препаратов (антибиотики, противовирусные, гормоны и др.);
• Для получения достоверного результата анализ желательно повторить через 2 недели.

Ответ ИФА можно ожидать в течение 1 суток после венепункции, а в экстренных ситуациях, когда обследование проводится по «cito» – около 3 часов.

• Информация с сайтов лаборатории Инвитро и Хеликс;
• Данные Национальной медицинской библиотеки США  PubMed.

Другие анализы ревматологического скрининга

• АСЛ-О (Анти-стрептолизин-О) 
• СРБ (С-реактивный белок)
• РФ (Ревматоидный фактор)

Расшифровка результатов

Интерпретацией занимаются иммунологи или другие, более широкие специалисты. Будь то терапевты, инфекционисты или прочие доктора.

Если предметом поиска выступают антитела (иммуноглобулины) — возможна группа находок.

Эти молекулы подразделяются на несколько типов, в зависимости от момента, когда вступают в работу:

LgM. В борьбу идут в самом начале. Обладают свойствами бактерицидов. Основная задача — формирование первичного иммунитета и нейтрализация токсинов, которые вырабатываются в ходе поражения организма инфекционным агентом.

Антитела LgM вырабатываются с самого проникновения инородной структуры в тело. Потому выявить патологический процесс с помощью ИФА можно даже тогда, когда симптомов еще нет.

• LgA. Класс иммуноглобулинов, которые так же синтезируются первыми, наравне с LgM. При этом, отвечают не за общую защиту, а за местный иммунитет. Например, за отражение атак на слизистые оболочки.
• LgE. Используются для диагностики аллергических реакций. Поскольку формируют комплексы, которые участвуют в разрушении тучных клеток, базофилов, выход гистамина. Почти у ¾ пациентов с аллергией, уровень иммуноглобулина оказывается больше нормы.
• LgG. Эти антитела отвечают за стойкий иммунитет. Концентрация повышается медленно, но верно и достигает пика через несколько недель.

Именно эти вещества отвечают за формирование длительных защитных свойств организма, устойчивости к определенному агенту, инородной септической структуре. Кстати, по концентрации LgG можно понять, как давно болеет пациент.

LgD. Функции до конца не изучены. Из того, что известно сейчас — принимают участие в регулировании иммунного статуса. Например, активизируют базофилы, стимулируют выработку специфических, смертоносных для бактерий и вирусов веществ.

Интерпретация проводится по факту обнаружения или количественному составу образца.

Если анализ ИФА положительный

   Когда человек получает положительный анализ ИФА на ВИЧ, необходимо сразу обратиться к лечащему врачу. Поставить окончательный вердикт о наличии или отсутствии ВИЧ инфекции может только врач специалист на основании точного исследования. Во всех случаях, когда ИФА положительный, назначают повторный анализ ПЦР на определение количества вируса. По комплексу данных врач делает вывод о скорости течения заболевания и особенностях развития вируса.

Что делать при положительном ИФА

Если анализ показал наличие вируса, то рекомендуется сделать второй анализ

Результаты ИФА считаются достоверными только после повторного проведения анализа и подтверждении результата.

При получении положительного теста необходимо проконсультироваться в врачом. Если из ряда тестов положительным оказался только один, анализ стоит повторить через несколько недель для получения достоверных данных.

Причиной ошибочного результата могут быть следы крови от предыдущего анализа.

Осложнения при анализах

Многие заболевания могут способствовать получению недостоверных данных:

• Заболевания щитовидной железы;
• Хронические простудные заболевания;
• Наличие паразитов.

Такие отклонения в здоровье не позволяют обнаружить вирусный след методом ИФА. Пациентам назначаются другие виды диагностики.

Что делать если показал отрицательный результат

Не стоит забывать, что срок сдачи анализа может попасть на время серонегативного окна, когда активность вируса снижена и он не определяется. Для того чтобы получить достоверный результат, необходимо провести повторный анализ через несколько недель.

Для анализа нельзя приносить кровь с собой, так как белок, который выявляют при ИФА быстро денатурирует, что поспособствует получению отрицательного результата.

Один из способов обнаружения клеток вируса в период окна это ПЦР. Перед этим анализом проводится полимеразно-цепная реакция, увеличивающая количество РНК-отрезков, что позволит сделать препарат более доступным для анализа.

ИФА метод диагностики ВИЧ

На фото – диагностический набор

С развитием науки методы анализа продолжают совершенствоваться. Крови требуется все меньше, а результат все точнее. В настоящее время используется анализ ИФА 4 поколения на ВИЧ. Достоверность такого метода значительно выше предыдущих вариантов.

Тест на ВИЧ 4 поколения позволяет дифференцировать ответные белки на группы и определять специфику вируса.

Кроме ИФА применяется еще несколько вариантов тестирования:

• Качественный ПЦР;
• Количественный ПЦР;
• Иммуноблоттинг;

Однозначно сказать, что лучше ПЦР или ИФА нельзя, так как разные методы эффективны в разные периоды активности вируса. Для достоверного вердикта, как правило, проводятся все варианты тестов.

Производителей реагентов для проведения Ифа достаточно много, как отечественных, так и зарубежных

Часто при обследовании у ВИЧ-положительных людей обнаруживают сопутствующие заболевания: хламидию цитомегаловирус, сифилис, трихомониаз и т.д. эти организмы могут способствовать неправильной диагностике, поэтому после лечения тест на ВИЧ повторяют.

Виды гепатита

Спровоцировать развитие гепатита могут не только вирусы, но и паразитические микроорганизмы, фармакологические средства, токсичные для печени, а также сбой в функционировании иммунной системы. В зависимости от природы происхождения почечную аномалию делят на пять видов.

• Болезнь Боткина (A) – наиболее часто встречающийся тип недуга. Характеризуется длительным инкубационным периодом от 7 до 50 дней. У больного, переболевшего этой формой гепатита, вырабатывается иммунитет ко всем остальным видам. B (HBV)- обладает 10% порогом перманентности. Симптомы могут быть схожи с ОРЗ. Период инкубации вируса около 2-3 месяцев.
• С (HCV) – в 80% случаев аномалия, приобретает хроническое течение. Симптоматика проявляется через неделю, иногда по истечении 3 месяцев. Заболевание может комбинироваться с другими видами гепатита. От почечной патологии этого вида не существует вакцины.
• D (HDV) – часто развивается одновременно с гепатитом B, заболевание сильно поражает печень. Латентность недуга до 7 недель.
• Е (HEV) – такой гепатит крайне опасен для беременных. В большинстве случаев имеет летальный исход. В группе риска жители Африки и стран Центральной Азии.

Любая вариация гепатита опасна для здоровья и требует правильного лечения. Своевременная вакцинация позволит избежать последствий заболеваний печени.